Development and application of lipidomics workflows: from untargeted towards targeted enantioselective lipidomics

Abstract

Structure and function of lipids have been subject of intense studies for more than one century. However, during this time, the meaning of lipid has changed considerably, and nowadays lipids are defined as “small molecules derived from carbanion-based condensation of thioesters and/or by carbocation-based condensations of isoprene units”. The development of modern analytical techniques in the last decades led researchers to undertake the comprehensive analysis of lipids in biological systems, which has been defined as lipidomics. Mass spectrometry (MS) has been the most important analytical tool for the exponential growth that lipidomics has achieved in the last twenty years. Two main approaches have been employed in MS: shotgun lipidomics (in which lipid extract is directly infused into the mass spectrometer without lipid separation) and liquid chromatography hyphenated to MS (LC-MS) based lipidomics (in which the lipid extract is first separated chromatographically before MS detection). In this thesis, LC-MS based lipidomics studies were developed in order to determine proper conditions for analysis of as many lipid species as possible and with the most confident level of description. In a first study, the performance of four extraction protocols was compared for the analysis of lipids in Hela cells. The comparison was based on performance parameters such as extraction recoveries of endogenous lipids and internal standards, precision, and complexity of the protocols. For the comparison two traditionally employed protocols, based on biphasic systems (chloroform -methanol (MeOH)-H2O, known as Bligh & Dyer, and methyl tert-butyl ether (MTBE)-MeOH-H2O, known as Matyash), and two novel protocols based on monophasic systems of isopropanol (IPA)-H2O (IPA:H2O 75:25 v/v and IPA:H2O 90:10 v/v) were selected. The analysis of lipids after extraction was performed by reversed-phase ultra- high performance liquid chromatography (UHPLC) coupled to quadrupole-time...

Alemán: Strukturen und Funktionen von Lipiden werden seit mehr als einem Jahrhundert intensiv untersucht. In dieser Zeit hat sich die Bedeutung von Lipiden jedoch erheblich geändert. Lipide werden heutzutage als "kleine Moleküle, die durch Kondensation von Thioestern auf Carbanionbasis und / oder durch Kondensation von Isopreneinheiten auf Carbokationbasis entstehen" definiert. Die Entwicklung moderner Analysetechniken der letzten Jahrzehnte veranlasste Forscherinnen und Forscher dazu eine umfassende Analytik von Lipiden in biologischen Systemen durchzuführen, welche schließlich als Lipidomik definiert wurde. Die Massenspektrometrie (MS) war seither das wichtigste analytische Instrument und zudem maßgeblich verantwortlich für das exponentielle Wachstum der Lipidomik in den letzten zwanzig Jahren. Im Allgemeinen werden zwei Hauptansätze in der MS verfolgt: Shotgun- Lipidomik (bei welcher der Lipidextrakt ohne Lipidtrennung direkt in das Massenspektrometer injiziert wird) und MS Lipidomik mittels Flüssigchromatographie Kopplung (LC-MS) (bei welcher der Lipidextrakt vor der MS-Detektion chromatographisch aufgetrennt wird). In dieser Arbeit wurden LC-MS-basierte Lipidomik-Studien entwickelt, um geeignete Bedingungen für die Analyse möglichst vieler Lipidspezies zu ermitteln und dabei eine äußerst zuverlässliche Beschreibung der Lipide zu gewährleisten. In einer ersten Studie wurden die Extraktionsausbeuten von vier Protokollen für die Analyse von Lipiden in Hela-Zellen verglichen. Der Vergleich basierte auf Parametern wie der Wiederfindung von endogenen Lipiden und internen Standards, sowie der Präzision und der Komplexität der jeweiligen Protokolle. Für den Vergleich wurden zwei klassische Protokolle, welche aus zweiphasigen Systemen (Chloroform-Methanol (MeOH) -H2O, bekannt als Bligh & Dyer, und Methyl-tert-butylether (MTBE) -MeOH-H2O, bekannt als Matyash) bestehen, und zwei neuartige Protokolle, die einphasige Systeme mit Isopropanol (IPA) -H2O...