Exploring protein phosphorylation dynamics by mass spectrometry: pushing the boundaries of time resolved phosphoproteomics

Abstract

The work presented in this thesis focuses on the study of protein phosphorylation in different experimental models, hence trying to answer different technical and/or biological questions. Still, all chapters share a common feature, and that is the study of changes in protein phosphorylation across time. This work shows that adding the temporal dimension to phosphoproteomics experiments greatly aids in data interpretation and extraction of biological insight. In chapter II, we used targeted phosphoproteomics to explore the phosphorylation dynamics of the MAPK-AKT-mTOR signaling pathway. Here we developed an SRM assay to measure functional phosphosites from this protein network, known to be a major player in determining cellular fate. Furthermore, by using an alternative protease for protein digestion we could access relevant phosphorylation sites that cannot be detected when applying tryptic digestion only. In a proof of principle experiment, we provide evidence of temporal differences in phosphorylation events responsible for the activity of this signaling pathway. Next, we used the assay to explore the cellular response to starvation of glucose or amino acids. This revealed an increase in AKT derived signaling, which functions as a pro-survival mechanism when cells are deprived of these nutrients. We think this chapter nicely shows the upside of targeted phosphoproteomics, since this technique allows to measure predefined phosphorylation sites of interest with high sensitivity and reproducibility. In chapter III, we used MS-based phosphoproteomics to study the differential role of the mitogen activated protein kinases (MAPK), ERK1 and ERK2 in the cellular response to growth factor treatment. These two enzymes locate at the core of the MAPK signaling pathway, and they are known drivers of cellular growth, proliferation and differentiation. Still, up to date is not known if they are redundant or if each kinase has specific functions. We show that depletion...

Holandés: Het werk in dit proefschrift richt zich op het onderzoeken van eiwit fosforylering in verschillende experimentele modellen, waarbij gepoogd wordt verscheidene technische en biologische vragen te beantwoorden. De hoofdstukken in dit proefschrift hebben allen gemeenschappelijk dat eiwit fosforylering wordt bestudeerd door de tijd heen. Dit werk laat zien dat het in acht nemen van de dimensie tijd in phosphoproteomics experimenten van groot belang is voor het interpreteren van de data en het verkrijgen van biologische inzichten. In Hoofdstuk 2 maken we gebruik van targeted phosphoproteomics om signaaltransductie door middel van eiwitfosforylering in de MAPK-AKT-mTOR signaleringsroute in kaart te brengen. De gepresenteerde SRM methode stelt ons in staat om functionele fosforyleringen te meten die een cruciale rol spelen in de lotsbestemming van een cel. Door middel van het gebruik van verschillende enzymen voor eiwit digestie, hebben we de methode kunnen uitbreiden met fosforyleringen die niet detecteerbaar zijn met trypsine alleen. In dit hoofdstuk wordt aan de hand van een voorbeeld duidelijk dat fosforyleringen in deze signaaltransductieroute tijdsafhankelijk zijn. Verder hebben we deze methode toegepast om te onderzoeken op welke manier deze signaleringsroute een rol speelt bij de cellulaire reactie op een tekort aan glucose en aminozuren. Onthouding van deze voedingsstoffen leidde in dit experiment tot een verhoogde AKT activiteit als overlevingsmechanisme. De voordelen van targeted phosphoproteomics komen in dit hoofdstuk duidelijk naar voren; deze techniek stelt ons in staat om belangrijke fosforyleringen met hoge sensitiviteit en reproduceerbaarheid te meten. In Hoofdstuk 3 hebben we de rol van ERK1 en ERK2 in signaaltransductie na behandeling met groeifactoren onderzocht. Deze enzymen spelen een cruciale rol in de MAPK signaalroute en drijven celgroei, proliferatie en differentiatie aan. Het is echter onduidelijk of deze kinases elk een specifieke...